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IP/Co-IP实验结果分析

一个成功的 Co-IP 实验,基于合理正确的实验结果,这不仅包含了蛋白质之间相互作用的结果检测,还要有全面合理的对照组。包括证明靶蛋白 X 和预测的相互作用的蛋白 Y,是否存在于蛋白质样品中的Input对照组,以及排除免疫球蛋白IgG本身亲和作用的对照组等。

 

 

我们一般常见最基本的Co-IP结果如上图,即验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用。分析该实验结果,被分为两组,即Input组和IP组。Input组表示蛋白X、Y在样品中是表达的,并且可以通过WB检测。IP组中IgG即为阴性对照,利用非相关的IgG进行沉淀实验,蛋白X与蛋白Y不会被IgG的非特异性亲和作用沉淀下来,用于排除蛋白与IgG的非特异性结合造成的假阳性结果。而IP组中Anti-Protein X组,是利用蛋白X的抗体进行沉淀实验,结果蛋白X被沉淀下来,蛋白Y也被沉淀下来,由此得到结论蛋白X与蛋白Y之间存在相互作用。


当目的蛋白在样本中表达含量较低,或没有合适的IP抗体时,我们可以考虑使用转染外源过表达质粒,来表达对应的带有标签的融合蛋白。以下图文献中的实验结果为例,验证带有FLAG标签的EDR1蛋白和带有GFP标签的EDR4蛋白之间的相互作用。实验被分为两组,第一组是过表达GFP标签蛋白及EDR1-FLAG蛋白,第二组则过表达了EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白。

 

Input:两组Input的WB结果显示,在目的细胞中,融合蛋白过表达成功,样本中有较为丰富的目的蛋白过表达。    

 

IP:利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀,图上显示两组实验在130kd都存在蛋白,说明两组实验的EDR1-FLAG均可被沉淀下来。

 

Co-IP:进一步检测GFP,图上显示第一组实验没有条带,而第二组实验在130kd处有蛋白。说明EDR1-FLAG可以通过相互作用,把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来,而不能与GFP标签相互作用,因此证明,EDR1蛋白可以与EDR4蛋白存在相互作用。

 

 

(文献来源:ENHANCED DISEASE RESISTANCE4 Associates with CLATHRIN HEAVY CHAIN2 and Modulates Plant Immunity by Regulating Relocation of EDR1 in Arabidopsis. Guangheng Wu, et, al. Plant Cell, 2015, 27(3): 857-873


 

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